动物模型在研究人类疾病（如不孕不育）中至关重要。近期研究显示，啮齿动物模型（如小鼠）与人类在睾丸细胞组成、分子特征和发育轨迹等方面存在显著差异【1】，这凸显了寻找替代动物模型的必要性，以更准确地模拟人类睾丸发育。猪（Sus scrofa）在多个解剖特征上与人类相似，如心脏占体重的比例、脑白质组成、肠道长度和表皮厚度等，因此，猪作为转化医学模型在器官移植、人类疾病模型构建、药物毒理学领域的应用日益广泛【2】。此外，猪是全球第二大肉类来源，中国的生猪出栏量和消费量均位居世界首位，生猪养殖在中国畜牧业中占据重要地位。生猪产业的健康、高效发展离不开优良品种的培育和覆盖，其中公猪的作用影响巨大。因此，系统解析猪的睾丸发育和精子发生，作为替代模型研究人类睾丸发育及相关疾病，对于发育生物学及医学领域具有重要意义；同时也将促进我国本土猪种的优良品种选育，具有显著的经济和社会价值。

近日，中国科学院动物研究所赵建国研究员、郭靖涛研究员和韩春生研究员团队合作在Communications Biology杂志上发表了题为Single-Cell Transcriptomic and Cross-Species Comparison Analyses Reveal Distinct Molecular Changes of Porcine Testes during Puberty的研究论文。本研究采用分子生物学和细胞生物学的方法，全面分析了巴马猪在胎儿期、新生儿期、青春期和成年期的睾丸发育，并进行了跨物种比较。这一研究推进了对猪睾丸发育复杂机制的理解，强调了其作为再生医学模型的潜力。

为深入了解猪精子发生的分子特征，研究团队比较了巴马猪、人类和小鼠在睾丸生殖细胞发育过程中的组成变化情况。研究人员意外地发现，巴马猪在出生后第9天（PD9）时已经出现细线期和粗线期精母细胞，明显早于小鼠，这表明其减数分裂启动时间更早。组织学验证显示，PD15的巴马猪睾丸内已可观察到明显的精母细胞。这一发现揭示了巴马猪在早期阶段即已启动精子发生过程，这可能与哺乳动物的第一波精子发生（first-wave spermatogenesis）现象类似，为巴马猪的性成熟时间以及繁育提供了重要启示和参考。

精原细胞通过自我更新和分化的平衡维持终生的精子发生。考虑到先前研究中人类与啮齿类模式动物的显著差异，研究团队将重点放在巴马猪的精原细胞上。通过无监督聚类，在未分化的巴马猪精原细胞和分化精原细胞中识别出四个不同的亚簇：SPG1至SPG4。伪时间分析进一步定义了从SPG1到SPG4的发展轨迹，其中SPG1代表最原始的精原细胞发育状态，SPG4则位于这一轨迹的末端。值得注意的是，以PIWIL4、EGR4和FGFR3的高表达为特征的巴马猪SPG1亚群，在转录水平非常类似于人类的State 0精原干细胞【3】，这些细胞在男性一生中保持未分化和静止的状态，表明它们可能是最原始的生殖干细胞。这是在除灵长类动物之外的物种中首次识别出此类细胞（图1）。

为深入了解间质细胞谱系的特异性，本研究对胎龄72天（E72）的巴马猪睾丸细胞进行了分析，并重新分析了已发表的E24、E27、E30和E35的雄性性腺单细胞转录组数据【4】。该综合数据集使研究人员能够探索间质细胞谱系的起源、动态和特化过程。研究人员识别出一个处于活跃增殖状态的间质亚群（Proliferating progenitors），以NR2F2、TOP2A和MKI67的高表达为特征。免疫荧光染色证实，巴马猪成体睾丸内存在潜在的间质祖细胞，表现出MKI67和ACTA2的共表达。这些发现表明，尽管传统观点认为睾丸体细胞处于有丝分裂停滞状态，但本研究在巴马猪中识别出了稀有的增殖间质细胞亚群，并且具有分化为间质或肌样细胞的潜力（图2）。此外，发现雄性巴马猪的Leydig细胞能够合成雌激素，其合成酶CYP19A1表达水平在成年期与睾酮合成酶CYP17A1相当，这与人类和小鼠的情况截然不同。

最后，研究人员发现胶质细胞源性神经生长因子（GDNF）信号在不同物种中维持精原干细胞的作用体现出了明显的保守性和多样性。小鼠的单细胞RNA测序数据显示，GDNF配体Gdnf主要在支持细胞和肌样/间质细胞中表达，而受体Gfra1在精原细胞中高表达。在人类中，GFRA1同样标记未分化的生精母细胞，但GFRA2的配体NRTN则在支持细胞中被检测到。与此不同，人类睾丸体细胞在转录水平几乎不表达GDNF。基于此，研究人员重新审视了巴马猪中GDNF信号的调控逻辑，推测支持细胞表达的NRTN作为旁分泌因子，可能在控制猪精原细胞的自我更新和分化方面起着核心作用。

总而言之，本研究为猪睾丸发育和精子发生提供了宝贵的见解，为未来在生殖生物学、动物育种的进展以及在转化医学中的潜在应用奠定了基础。

本研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金委员会、科技创新2030等项目的资助。中国科学院动物研究所赵建国研究员、郭靖涛研究员、韩春生研究员为共同通讯作者；中国科学院动物研究所博士后王晓琰、王杨和中国科学院动物研究所博士研究生王煜、郭一菲为本文共同第一作者。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s42003-024-07163-9

参考文献：

1. Shami AN,Zheng X,Munyoki SK,Ma Q,Manske GL,Green CD,Sukhwani M,Orwig KE,Li JZ,Hammoud SS. Single-Cell RNA Sequencing of Human,Macaque,and Mouse Testes Uncovers Conserved and Divergent Features of Mammalian Spermatogenesis. Dev Cell. 2020 Aug 24;54(4):529-547.e12.

2. Anand RP, Layer JV, Heja D, Hirose T, Lassiter G, Firl DJ, Paragas VB, Akkad A, Chhangawala S, Colvin RB, Ernst RJ, Esch N, Getchell K, Griffin AK, Guo X, Hall KC, Hamilton P, Kalekar LA, Kan Y, Karadagi A, Li F, Low SC, Matheson R, Nehring C, Otsuka R, Pandelakis M, Policastro RA, Pols R, Queiroz L, Rosales IA, Serkin WT, Stiede K, Tomosugi T, Xue Y, Zentner GE, Angeles-Albores D, Chris Chao J, Crabtree JN, Harken S, Hinkle N, Lemos T, Li M, Pantano L, Stevens D, Subedar OD, Tan X, Yin S, Anwar IJ, Aufhauser D, Capuano S, Kaufman DB, Knechtle SJ, Kwun J, Shanmuganayagam D, Markmann JF, Church GM, Curtis M, Kawai T, Youd ME, Qin W. Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation. Nature. 2023 Oct;622(7982):393-401.

3. Guo J,Grow EJ,Mlcochova H,Maher GJ,Lindskog C,Nie X,Guo Y,Takei Y,Yun J,Cai L,Kim R,Carrell DT,Goriely A,Hotaling JM,Cairns BR. The adult human testis transcriptional cell atlas. Cell Res. 2018 Dec;28(12):1141-1157. doi: 10.1038/s41422-018-0099-2.

4. Chen M,Long X,Chen M,Hao F,Kang J,Wang N,Wang Y,Wang M,Gao Y,Zhou M,Duo L,Zhe X,He J,Ren B,Zhang Y,Liu B,Li J,Zhang Q,Yan L,Cui X,Wang Y,Gui Y,Wang H,Zhu L,Liu D,Guo F,Gao F. Integration of single-cell transcriptome and chromatin accessibility of early gonads development among goats,pigs,macaques,and humans. Cell Rep. 2022 Nov 1;41(5):111587.

图1 巴马猪精子发生启动早，并且精原干细胞存在异质性

图2 在巴马猪睾丸内发现一类持续存在的增殖间质祖细胞